Bacteriófagos com potencial aplicabilidade em tubos endotraqueaisavaliação das atividades antibacteriana e antibiofilme
Potential applicability of bacteriophages on endotracheal tubes: evaluation of antibacterial and antibiofilm activities
Publication year: 2021
O objetivo deste estudo foi isolar bacteriófagos com potencial aplicabilidade no controle de biofilme de Pseudomonas aeruginosa em tubos endotraqueais. Os bacteriófagos isolados foram expandidos, titulados e caracterizados quanto ao perfil genômico, morfologia, tipo de material genético, especificidade de hospedeiros, eficiência de plaqueamento, atividade lítica, curva de crescimento e estabilidade às variações de pH e temperatura. A inibição do crescimento planctônico e a atividade antibiofilme, in vitro, foram avaliadas contra 15 cepas de P. aeruginosa. A atividade antibiofilme de tubos endotraqueais revestidos com os bacteriófagos foi avaliada em um modelo de biofilme em fluxo contínuo. A influência dos bacteriófagos sobre os fatores de virulência de P. aeruginosa foi avaliada pela inibição da formação de biofilme, produção de piocianina e proteases extracelulares e expressão dos genes pslA, lasl, lasB e phzH. Os dados referentes a área recoberta por biofilme após o tratamento com os bacteriófagos e a atividade antibiofilme de tubos endotraqueais revestidos apresentaram distribuição não normal e foram analisados em um Modelo Linear Generalizado (α=5%). A influência dos bacteriófagos sobre os fatores de virulência de P. aeruginosa também apresentou distribuição não normal e foi analisada pelo teste de Kruskal-Wallis (α=5%). Todas as demais variáveis apresentaram distribuição normal e variância homogênea e foram analisadas por ANOVA (α=5%). Vinte e cinco bacteriófagos foram isolados a partir de amostras do esgoto doméstico. Do total, 5 bacteriófagos foram selecionados para caracterização integral e avaliação das atividades antibacteriana e antibiofilme. Eles foram designados como vB_PaeM_USP_1, vB_PaeM_USP_2, vB_PaeM_USP_3, vB_PaeM_USP_18 e vB_PaeM_USP_25. Os bacteriófagos pertencem à ordem Caudovirales, família Myoviridae, com genoma constituído por DNA dupla fita (dsDNA), variando de ~62 a ~65 kb e codificam de 65 a 89 proteínas. Os bacteriófagos produziram de 27 a 46 partículas virais após 30 minutos de incubação e foram estáveis às variações de pH e temperatura. Os bacteriófagos exibiram um amplo espectro lítico e foram capazes de infectar P. aeruginosa, incluindo cepas multirresistentes. Eles também reduziram o crescimento de P. aeruginosa na forma planctônica, e a carga microbiana e atividade metabólica quando aplicados a biofilmes associados aos tubos endotraqueais. A área recoberta por biofilme foi significativamente reduzida após a exposição de biofilmes maduros aos bacteriófagos. A aplicação in situ dos bacteriófagos no revestimento de tubos endotraqueais mostrou que o coquetel composto por vB_PaeM_USP_2 e vB_PaeM_USP_18 alterou a colonização bacteriana e o desenvolvimento do biofilme de P. aeruginosa, sem afetar substancialmente a atividade metabólica. Avaliando os fatores de virulência de P. aeruginosa foi observado que os vírus promoveram mudanças no crescimento do biofilme apenas até 8 horas de cocultivo. Também, após 8 horas de cocultivo foi observado que vB_PaeM_USP_1, vB_PaeM_USP_2 e vB_PaeM_USP_3 promoveram filamentação da morfologia bacteriana. A presença de bacteriófagos não alterou a produção de piocianina e proteases extracelulares por P. aeruginosa. No entanto, alterações no nível de expressão de genes relacionados a fatores de virulência foram detectadas, principalmente, após 2 e 48 h de cocultivo. A atividade lítica no biofilme de P. aeruginosa formado por cepas multirresistentes indica que os bacteriófagos isolados neste estudo podem ser considerados bons candidatos para estudos terapêuticos.
The objective of this study was to isolate bacteriophages and potentially apply it against Pseudomonas aeruginosa biofilms on endotracheal tube surfaces. The isolated bacteriophages were propagated, titrated, and characterized in terms of their genomic profile, viral morphology, type of genetic material, host range investigation, efficiency of platting, lytic activity, growth curve, and pH and thermal stability. The inhibition of planktonic growth and antibiofilm activity, in vitro, were evaluated against 15 P. aeruginosa strains. The antibiofilm activity of endotracheal tubes coated with bacteriophages was evaluated in a continuous flow biofilm model. The bacteriophages influence on development of virulence mechanisms on P. aeruginosa was evaluated by the inhibition of biofilm growth, production of pyocyanin and extracellular proteases, and expression of pslA, lasl, lasB and phzH genes. Data referring to the residual aggregated biofilm after treatment with bacteriophages and the antibiofilm activity of endotracheal tubes coated with bacteriophages showed non-normal distribution and were analyzed in a Generalized Linear Model (α=5%). The bacteriophage's influence on development of virulence mechanisms on P. aeruginosa also showed non-normal distribution and was analyzed by Kruskal-Wallis test (α=5%). All other data had normal distribution and homogeneous variance and were analyzed using ANOVA (α=5%). Twenty-five bacteriophages were isolated from domestic sewage samples. Of these, 5 bacteriophages were selected for complete characterization and evaluation of antibacterial and antibiofilm activities. They were designated as vB_PaeM_USP_1, vB_PaeM_USP_2, vB_PaeM_USP_3, vB_PaeM_USP_18 and vB_PaeM_USP_25. All of them belong to the order Caudovirales, Myoviridae family, and they have a double-stranded DNA (dsDNA) genome ranging from ~62 kb to ~65 kb that codes from 65 to 89 proteins. The bacteriophages produced from 27 to 46 particles after 30 minutes of incubation and were pH and heat stable. Bacteriophages exhibited a broad lytic spectrum and were able to infect P. aeruginosa, including multidrug-resistant strains. They also reduced the growth of P. aeruginosa strains in planktonic form, and microbial load and metabolic activity when applied to biofilms associated with endotracheal tubes. Biofilm-coated area were significantly reduced after treatment of mature biofilms with bacteriophages. The in situ application of bacteriophages in endotracheal tubes revealed that the cocktail composed by vB_PaeM_USP_2 and vB_PaeM_USP_18 promoted changes in colonization and biofilm growth processes without, substantially, altering the metabolic activity. Assessing the virulence mechanisms of P. aeruginosa it was observed that the virus promoted changes in P. aeruginosa biofilm growth only up to 8 h of co-incubation. In addition, after 8 h of co-incubation, it was observed that vB_PaeM_USP_1, vB_PaeM_USP_2 and vB_PaeM_USP_3 promoted filamentation of bacterial morphology. Bacteriophage presence did not alter both pyocyanin and protease production by P. aeruginosa. However, changes in the expression level of genes related to virulence factors were detected mainly after 2 and 48 h of co-culture. The lytic activity on multidrug-resistant P. aeruginosa biofilm indicates that isolated bacteriophages in this study may be considered as good candidates for therapeutic studies
